Projektbeschreibung Glöckner

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Entwicklung von gentherapeutischen Werkzeugen, welche zielgerichtet neuronale Zellzyklusaktivierung hemmen sollen - ein kritisches Ereignis in der pathologischen Kaskade von neuronalem Zelltod bei der Alzheimerschen Erkrankung

Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimersche Erkrankung gehören noch immer zu den ganz großen Herausforderungen in der Wissenschaft. Sie stellen eine enorme sozioökonomische Belastung mit einem hohen medizinischen Aufwand dar.

Die Alzheimersche Erkrankung ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung des Menschen und zugleich die häufigste Ursache einer Demenzerkrankung im Alter. Die Ursachen dieser schweren Erkrankung sind bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht geklärt und es gibt keine effektive Prävention bzw. Therapiestrategie. Die klinischen Symptome und die Neurodegeneration werden durch die Bildung von extrazellulären senilen Plaques, überwiegend bestehend aus dem Peptid Amyloid-ß (Aß), einem Spaltprodukt des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) hervorgerufen. Neben den Plaques stellen die neurofibrillären Bündel oder auch Tangles das zweite Charakteristikum dar. Hauptbestandteil der Tangles ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau.

Diese pathologischen Strukturen führen u.a. zu einem Absterben umliegender Neuronen. Noch vor jeder fibrillären Ablagerung, sind lösliche molekulare Aggregate des Amyloid-ß (z.B. Dimere und Oligomere) wahrscheinliche Auslöser von pathologische Kaskaden, die zu neurodegenerativen Prozessen führen. Bei der Alzheimerschen Krankheit und anderen neurodegenerativen Prozessen wird in der Literatur beschrieben, dass die Neuronen eine verstärkte Expression von Zellzyklus-Proteinen (Cyklin-abhängige Kinasen (CDKs), Cycline, Proliferationsmarker, Cdk-Inhibitoren (CDKis)) aufweisen. Das ist ein Hinweis für einen Wiedereintritt der differenzierten Neuronen in den Zellzyklus, dieser kann jedoch nicht vollständig durchlaufen werden und es kommt zur Apoptose. Vermutlich treiben verschieden mitogene Faktoren eine Aktivierung von Signaltransduktionskaskaden an, verbunden mit einer Störung der Zellzyklusaktivierung. Es wurde bereits beschrieben, dass auch Amyloid-ß Oligomere mögliche Auslöser für einen Wiedereintritt der Neuronen in den Zellzyklus sein können und somit diese an neuronalen Zelltod beteiligt sind. Die Kontrolle des Zellzykluses erfolgt durch Cyclin-abhängigen Kinasen, die wichtige Funktionen in den einzelnen Zellzyklus-Phasen einnehmen. Zudem erfolgt die Regulation der CDK/Cyclin-Aktivität über eine Reihe von Phosphorylierungs- oder Dephosphorylierungsereignissen und durch die Wirkung von CDK-Inhibitoren. Diese Inhibitoren binden und hemmen den Cdk-Cyclin-Komplex.

Es ist bekannt, dass Cyklin-abhängige Kinasen wie CDK4, CDK6 und CDK1 an pathologischen Phosphorylierungsprozessen beteilligt sind und die CDK4 auch eine wichtige Rolle bei der Induktion von neuronaler Apoptose spielt. Das Konzept dieses Projektes basiert auf der Hemmung des Wiedereintritts der Neuronen in den Zellzyklus durch eine Runterregulierung der CDK1-, CDK4- & CDK6- Aktivität mittels transgener Expression ihrer physiologischen Inhibitoren. Es wurde bereits durch transgene Ansätze gezeigt, dass die gezielte Überexpression von p16INK4a in in vivo Modellen der Neurodegeneration, neuroprotektive Effekte erzielt. Unser Ziel in diesem Projekt ist es, ein neues gentherapeutisches Werkzeug zu entwickeln, welches eine sichere, langanhaltende, neuronspezifische und regulierbare Transgenexpression mit neuroprotektiven Hintergrund garantiert. Als Basis für das Genshuttlesystem sollen nicht integrierende lentivirale Vektoren verwendet werden. Die zellspezifische Expression der CDKis werden unter Kontrolle eines neuronspezifischen Promotors stehen. Der Vektor kann je nach Expressionslevel des Transgens weiter modifiziert werden. Ist eine Erhöhung der Expression erforderlich, so kann eine verstärkte Promotoraktivität z.B. über Fusion mit einem CMV- (Cytomegalievirus) Enhancer (Hybrid-Promoter) oder Einbau des WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) erreicht werden. Die Regulierung der Transgenexpression soll durch das Tet-on/off-System gesteuert werden.

Die Blut-Hirnschranke stellt eine bedeutende Hürde für eine vektorvermittelte Gentherapie in das Gehirn dar. Diese Hürde soll u.a. mittels convection-enhanced-delivery (CED) überwunden werden. Die neuentwickelten Vektoren, sollen in verschiedenen transgenen Mäusen mit amyloid-ß Pathology getestet und dabei die CDK4 und CDK6 Aktivität spezifisch in Neuronen reguliert werden. Die Effekte dieser gentherapeutischen Anwendung sollen u.a. im Hypocampus und im Neocortex mittels verschiedenen Markern (neuronal, microglia, astrolglia) quantifiziert und analysiert werden.

 

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