Matthias Fassler

Zusammenfassung der Arbeit

Die Alzheimer Erkrankung ist die häufigste Form von Demenz bei älteren Menschen. Die Hauptkomponente der amyloiden Plaques im Gehirn von Alzheimer Patienten sind die Aβ Peptide, welche durch die Aktivität der g-Sekretase in den extrazellulären Raum gelangen. Die g-Sekretase ist ein multimerer Komplex von hohem Molekulargewicht und besteht aus den Untereinheiten Präsenilin (PS), Nicastrin, anterior pharynx-defective phenotype 1 (Aph1) und PS enhancer 2 (Pen2). In einer vorausgehenden Arbeit wurde ein Qualitätskontrollmechanismus für den Zusammenbau der g-Sekretase vorgeschlagen. Dieser Mechanismus basiert auf Retentionssignalen, welche die isolierten Untereinheiten und Zwischenformen des Zusammenbaus im endoplasmatischen Retikulum (ER) halten. Diese Signale werden im korrekt assemblierten Komplex inaktiviert und die g-Sekretase wird an die Plasmamembran und in die Endosomen transportiert, wo sie aktiv ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Belege für die vorgeschlagene Qualitätskontrolle beim Zusammenbau der g-Sekretase zu finden.
Der erste Schritt dieser Arbeit war die Identifizierung von ER Retentionssignalen in den verschiedenen Untereinheiten der g-Sekretase. Durch die Anwendung von Reporterproteinen konnten zwei neuartige ER Retentionssignale identifiziert werden, welche in der Transmembrandomäne (TMD) 4 von PS1 und der TMD1 von Pen2 liegen. Beide Signale basieren auf polaren Aminosäuren im hydrophoben Umfeld einer TMD. Das Signal in der Pen2-TMD1 trägt außerdem zur Stabilität von Pen2 bei. Die Mutagenese der zwei bekannten Retentionssignale in PS1 (TMD4 und TMD9) führte nicht zum Export von PS1 aus dem ER. Daher ist zu vermuten, dass es weitere Signale in PS1 gibt, entweder in den verbleibenden 7 TMD oder in den zytoplasmatischen Bereichen von PS1.
Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit zielte auf die Identifizierung von Komponenten, welche die TMD-basierte ER Retention vermitteln. Retention in the ER 1 (Rer1) wurde als ein Protein identifiziert, das zur ER Retention von Pen2, jedoch nicht von PS1, beiträgt. Pen2 ist das erste bekannte Substrat von Rer1 in Säugetierzellen wobei Rer1 mit Pen2 durch die Bindung an die Pen2-TMD1 interagiert. Die Unabhängigkeit des Signals in der PS1-TMD4 von Rer1 impliziert, dass es weitere bisher unbekannte Mechanismen gibt, welche zur TMD-basierten ER Retention beitragen.
Als Drittes wurde ein Mechanismus aufgeklärt, durch welchen ER Retentionssignale in der assemblierten g-Sekretase inaktiviert werden. Ergebnisse von uns und anderen zeigten bereits, dass die Pen2-TMD1 und die PS1-TMD4 notwendig für die Interaktion von PS1 und Pen2 sind. Dementsprechend sind beide TMD bifunktional, da sie sowohl zu einer Protein-Protein Interaktion als auch zur ER Retention beitragen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Protein-Protein Interaktion zu einer Maskierung und somit zur Inaktivierung der Retentionssignale in beiden TMD führt. Auf diese Art und Weise sind beide Funktionen der TMD aneinander gekoppelt. Diese Kopplung kann von der ER Qualitätskontrolle genutzt werden, um den Prozess des Zusammenbaus der g-Sekretase zu überwachen. Höchstwahrscheinlich kann dieser Mechanismus für andere multimere Proteine wie Ionenkanäle und Rezeptoren an der Plasmamembran verallgemeinert werden.
Darüber hinaus wurde hier gezeigt, dass die stabile überexpression der PS1-TMD4 den beschriebenen Qualitätskontrollmechanismus stört und somit den Zusammenbau der g-Sekretase verhindert. Diese Beobachtung hebt die Rolle der TMD der g-Sekretase nochmals hervor. Zudem eröffnet sie eine Möglichkeit zur pharmakologischen Beeinflussung der g-Sekretase über ihre TMD, welche genutzt werden könnte, um dieses wichtige Enzym bei pathologischen Zuständen zu inhibieren.

 

Projektbeschreibung

Zusammenfassung der Promotion “Zum Verständnis der Rolle von Rer1 beim Zusammenbau der g-Sekretase“

Die g-Sekretase ist ein Proteinkomplex mit großem Molekulargewicht bestehend aus den 4 Untereinheiten Presenilin (PS), Nicastrin, Aph1 und Pen2. Der fertige g-Sekretasekomplex zeigt die Aktivität einer Protease und spaltet verschiedene Substrate wie das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) innerhalb ihrer Transmembrandomänen. Dadurch vermittelt die g-Sekretase den letzten Schritt in der Produktion des Amyloid-b-Peptides (Ab). Ab ist die Hauptkomponente der Amyloidplaques in den Gehirnen von Alzheimer Patienten.


Der g-Sekretasekomplex assembliert sich im endoplasmatischen Retikulum (ER) und wird anschließend zu den Orten der g-Sekretaseaktivität transportiert. Eine Qualitätskontrolle stellt sicher, dass nur vollständig und korrekt assemblierte g-Sekretase das ER verlässt. Nach unserer Hypothese liegen diesem Mechanismus ER-Retentionssignale zu Grunde, welche die nicht-assemblierten Untereinheiten im ER zurückhalten. Durch den Zusammenbau des Komplexes werden diese Signale maskiert und der Komplex interagiert nicht länger mit Proteinen, welche die ER-Retention vermitteln.
Wir haben bereits in den Untereinheiten PS1 und Pen2 ER-Retentionssignale identifiziert, welche innerhalb der Transmembranbereiche der Proteine liegen. Des Weiteren haben wir das Protein Rer1 identifiziert, dass die ER-Retention der Untereinheit Pen2 über eine Transmembrandomäneninteraktion vermittelt. Deshalb vermuten wir, dass Rer1 durch seine Interaktion mit Pen2 einen Einfluss auf den Zusammenbau der g-Sekretase hat.


Im vorgeschlagenen Projekt wollen wir den molekularen Mechanismus des Zusammenbaus des g-Sekretase näher untersuchen. Insbesondere wollen wir die Rolle von Rer1 bei diesem Prozess aufklären. Es wird ein siRNA Screen durchgeführt, um Interaktionspartner der transmembranbasierten Retention zu identifizieren. Zu diesem Zweck werden wir Reporterproteine verwenden, welche Rer1-abhängig im ER zurückgehalten werden. Die Lokalisation dieser Reporterproteine dient als Sensor für die Integrität der Rer1-basierten Qualitätskontrolle. Zellen, die diese Reporterproteine stabil exprimieren, werden mit einer siRNA-Bank transfiziert. Anschließend wird die Lokalisation der Reporterproteine über High Content Mikroskopie analysiert. Zusätzlich werden wir nach direkten Interaktionspartnern von Rer1 suchen. Dazu werden wir einen auf einer humanen Gehirn-cDNA-Bank basierenden Hefe-Zwei-Hybrid-Screen durchführen. Es ist wahrscheinlich, dass wir in den beschriebenen Screens Proteine identifizieren, welche den Qualitätskontrollmechanismus für die g-Sekretase beeinflussen. Diese Proteine werden dann näher untersucht, um ihre exakte Funktion beim Zusammenbau der g-Sekretase aufzuklären.

 

 

Lebenslauf

Name Matthias Faßler
Geburtsort Jena
Geburtsdatum 28.10.1980
   
seit 2005 Doktorand bei Dr. Christoph Kaether, AG Membrantransport, Fritz-Lipmann-Institut Jena
2002-2003 Tutor, FSU Jena
2002-2005 Studium der Biochemie und Molekularbiologie an der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Wahlpflichtfach molekulare Medizin, Abschluss als Diplom-Biochemiker/ Molekularbiologe, Note 1,3
 

Publikationen

Kaether, C., Scheuermann, J., Fassler, M., Zilow, S., Shirotani, K., Valkova, C., Novak, B., Kacmar, S., Steiner, H. and Haass, C. (2007) Endoplasmic reticulum retention of the gamma-secretase complex component Pen2 by Rer1. EMBO Rep, 8, 743-748.

 

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